Identification et caractérisation moléculaire des bactéries lactiques lasées sur les techniques déemplification de séquences spécifiques d'ADN par la méthode PCR
Identification et caractérisation moléculaire des bactéries lactiques lasées sur les techniques déemplification de séquences spécifiques d'ADN par la méthode PCR
Fichiers
Date
2006-06-25
Auteurs
BENSALAH Farid
Nom de la revue
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Titre du volume
Éditeur
Université Oran 1 Ahmed Ben Bella
Résumé
Les techniques actuelles de biologie moléculaire ont permis de mettre en évidence une forte diversité génomique chez les bactéries lactiques. Ces dernières offrent une parfaite innocuité et sont largement présentes dans les procédés industriels de fermentation à caractère agroalimentaire ou ayant une approche thérapeutique (les probiotiques). Les méthodes d'identification phénotypiques classiques (physicochimiques, morphologiques...) utilisées dans nos laboratoires sont peu résolutives et ne permettent pas une discrimination au niveau des espèces. Ces observations ont été rapportées par plusieurs auteurs, en particulier pour les souches atypiques isolées à partir d'une flore microbienne autochtone. Les travaux entrepris dans cette étude se sont consacrés à l'identification et la caractérisation moléculaire de souches lactiques isolées à partir de lait fermentés de différentes origines: chèvre, vache, brebis et chamelle toutes de race locale. Les techniques basées sur l'identification par l'amplification en chaine de l'ADN (PCR), ainsi que le séquençage de gènes et l'analyse de séquences par bioinformatique ont été utilisés Ces méthodes permettent de caractériser et d'accéder à la biodiversité des bactéries lactiques par l'identification de gènes spécifiques de chaque souche. En effet, 40 isolats de lait fermenté local ont fait l'objet d'une identification par amplification et séquençage de l'ADNr 16S. Ainsi l'analyse d'alignement de séquences dans une banque de données ont permis d'identifier et de diversifier les lactocoques des entérocoques. De plus, l'amplification PCR et l'analyse de séquences génétiques discriminantes des gènes d'aminopeptidases (pepN, pepo), par l'utilisation d'amorces spécifiques (170/171, 493/494) ont permis une identification de l'espèce Lactococcus lactis. Par ailleurs, l'identification des entérocoques par analyse moléculaire du gène de l'ADNr 16S se limite au genre Enterococcus, de ce fait, une investigation a été menée par l'amplification génique (PCR) de locus spécifiques du gène sodA (manganese-dependent superoxide dismutase) par l'utilisation de primers universels sodA1/sodA2, et de primers spécifiques Efm1/Efm2, Efs1/Efs2, Ehl/Eh2 pouvant identifier respectivement le genre Enterococcus d'une part, et les espèces Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis et Enterococcus hirae d'autre part. Une autre approche ayant un intérêt en technologie fromagère concernant les lactocoques a été traitée. En effet, des études consacrées à la thermotolérance (choc thermique à 63-68°C, 30 min) de ces souches a montré un niveau de survie cellulaire très important par rapport aux souches de référence utilisées (souches INRA). En dernier lieu, un plasmide appelé pSU100 de 5,3 Kb a été isolé et purifié sur gradient de Chlorure de Césium par ultracentrifugation de Lactobacillus casei, il a été cloné dans le vecteur de transformation Puc18 chez Escherichia coli JM103. Les profils électrophorétiques de restriction obtenus par des digestions simples, doubles et triples sous l'action de 33 endonucléases ont contribué à l'élaboration d'une carte de restriction de ce plasmide. Le développement de méthodes moléculaires par le typage des bactéries lactiques ont permis de sélectionner et de caractériser de nouvelles espèces locales qui permettront d'enrichir et de mieux gérer à l'avenir notre banque de souches. Cette stratégie pourvoira différentes perspectives qui feront l'objet de thèmes de recherche (activité protéolytique, recherche de bactériocines, résistance aux phages...), d'autant plus que les outils moléculaires requis sont mieux maîtrisés pour identifier et repérer les bactéries lactiques isolées des différentes niches écologiques.
Description
Mots-clés
ADN; PCR; analyse moléculaire du gène; bactéries lactiques; la biodiversité; physicochimiques; morphologiques; Lactococcus lactis; activité protéolytique; souche